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* 过氧化氢酶米氏常数的测定 河南科技大学医学院 生物化学与分子生物学教研室 【目的】 【目的】 掌握米氏方程及其意义。 掌握过氧化氢酶米氏常数测定的原理、方法和步骤。 【原理】 1. 米氏方程 【原理】 米氏方程：当环境温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应速度v 与底物浓度[S]的关系符合米氏方程。 v = ──── Vmax[S] Km +[S] Vmax：最大反应速度 Km：米氏常数 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 20 40 60 80 底物浓度 [S] Vm 2 Km 初速率 v Vm 动力学曲线 Km值：可通过对米氏方程作图(V~[S]图)求出。在数值上等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度值。单位是mol/L(或mmol/L)。 当v = ── 时， Km = [S] Vm 2 以不同的底物浓度[S]为横坐标，[S]/v为纵坐标，将各点连成一直线，并向纵轴方向延长，此延长线在横轴上的截距即为–Km值。 2. 汉斯方程 2. 汉斯方程 v = ──── Vmax[S] Km +[S] 在实际应用中，通过动力学曲线求Km值，即使用很大的[S]，也只能得到趋近于Vm的反应速度，难以达到真正的Vmax，因此测不到准确的Km值。为得到准确的Km值，可以把米氏方程转化为 y = ax + b 的直线方程，然后用图解法求出Km值。本实验采用汉斯作图法(Hanes Plot)求Km值。将米氏方程两边取倒数再乘以[S]即为汉斯方程： (汉斯方程式) ── = ── . [S] + ── 1 Vm [S] v Km Vm 方程式两边取倒数再乘以[S] 汉斯方程作图 ── [S] v 1 斜率 = ── Vm 0 [S] Km ── Vm –Km 3. 鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理 本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其Km值和Vm值。 2