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（二）HCV核酸检测的方法 1、RT-PCR检测技术 传统PCR定性检测HCV RNA需要三个步骤：①对待测样品进行处理：通过裂解、纯化，提取样品中的HCV RNA作为PCR扩增的模板；②采用逆 转录PCR（RT-PCR）技术对提取到的HCV RNA进行扩增；③检测PCR扩增产物，检测方法包括凝胶电泳和PCR-酶联免反应（PCR-ELISA）等。 第三十一页，共53页 2、TMA检测技术 TMA是一种利用MMLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA的反应系统。TMA使用的引物含有T7 RNA聚合酶 结合位点，使得反转录合成的cDNA可以作为T7 RNA聚合酶的模板，在T7 RNA聚合酶的作用下合成大量的RNA拷贝。扩增出来的RNA重新进入TMA 循环，成为下一轮复制的模板。TMA优点在于特异性强、灵敏度高，反应条件简单、扩增只需一个温度，无需专门的热循环仪器，且因整个反应在一个试管中进行，扩增产物RNA易于降解，从而大大减少了污染的可能。 基于TMA技术的VERSANT HCV RNA定性检测可检测到极低水平的HCV RNA，甚至可低至5IU/ml。 第三十二页，共53页 3、实时荧光定量PCR技术 荧光定量PCR基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理，当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为FRET。基于FRET原理，出现了不同种类的荧光PCR，主要体现在探针设计的不同，如TaqMan探针、分子信标和荧光杂交探针。以目前我国应用最广泛的TaqMan荧光标记探针的定量PCR为例，是在探针（probe）的两端偶联一个短波长的荧光基团（报告基团）和