PCR引物设计原理.ppt

PCR引物设计原理;PCR反应一般由三个步骤组成：① 模板的热变性；② 引物复性到单链模板上；③ 热稳定DNA聚合酶催化的延伸;;变性;复性温度（退火温度）至关重要！！！

退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低；

退火温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增；

退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 ℃下进行。

最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 ℃内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。;对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-78 ℃，时间约为1min。;引物设计要点;（3）重复或自身互补序列：

形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。;（4）上下引物的互补性：

一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。

当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3'末端都不能和 其他任何引物互补。

;（5）解链温度（Tm 值）：

计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ℃，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10 ℃；引物的 Tm 值一般为50-70℃。

这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。;（6）3’末端

3’末端的性质非常关键。

如果可能的话，每个引物的3’末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A；

但不推荐3’末端有….NNNCG或…..NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。

;当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大降低；

当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般 PCR 反应中，引物3’末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。