等电点聚焦电泳仪：测定蛋白质等电点.doc

等电点聚焦电泳仪：测定蛋白质等电点

　聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点

　一、目的：

　学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。

　二、原理：

　等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrofocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。

　等电点聚焦电泳产生pH梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。

　理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：

　R1和R2为氢或带有氨基的脂肪基。这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Se