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RT-PCR原理与实验操作步骤

　一、知识背景：

　1、基因表达：DNA RNA Protein

　单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白） 共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。

　2、PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

　在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

　A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；

　B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

　C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’ 3’方向延伸。

　以上三步为一个循环，如此反复。

　3、逆转录酶和RT-PCR

　逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

　1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；

　2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；

　3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.

　二、RT-PCR的准备：

　1、引物的设计及其原则：

　1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

　2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括