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文档介绍

PCR假阴性和假阳性原因分析与解决方案

一、假阴性:不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备, ②引物的质量与特异性, ③酶的质量及, ④

PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有 Taq 酶抑制剂, ③模板中蛋白质没有消化

除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多, 或吸入酚。⑤模板核酸变

性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带, 极有可能是标本的消化处理,模板核酸提

取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活: 需更换新酶, 或新旧两种酶同时使用, 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导

致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物: 引物质量、 引物的浓度、 两条引物的浓度是否对称, 是 PCR失败或扩增条带不 理

想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高, 一条浓

度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。 ②引物的浓度不

仅要看 OD 值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两 引

物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做 PCR 有可能失败,

应和引物合成单位协商解决。 如一条引物亮度高, 一条亮度低, 在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存, 防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分, 导致引物变质 降解

失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度:Mg2+ 离子浓度对 PCR扩增效率影响很大, 浓度过高可降低 PCR扩增的特 异

性, 浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使 PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变:通常进行 PCR扩增采用的体积为 20ul 、30u

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