细胞与分子生物学技术.ppt

生物大分子(biomacromolecule)  核酸: 核苷酸（碱基，核糖，磷酸） DNA RNA (mRNA,tRNA,rRNA, siRNA ,miRNA ……) 分子杂交技术－筛选21三体（间期） 腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID) 病因: 淋巴细胞缺乏ADA 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年 ? 核酸和蛋白质的结构与功能及相互作用是分子水平生命活动的基础； ? 内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根本原因。 核酸（DNA，RNA）和蛋白质是生物体中最重要的生物大分子，是分子生物学研究和分子诊断的对象。 核酸的化学组成 DNA的双螺旋结构 特征： ①两条链以反向平行的方式围绕同一中心轴向右盘绕 ②主链处于螺旋的外侧（核糖+磷酸） 亲水核糖平面与螺旋轴平行 碱基处于螺旋的内侧，与中轴垂直 ③螺距：10bp—3.4nm—3600 ?=2nm ④大沟与小沟： 蛋白质识别DNA的特定遗传信息的关键点 ⑤ 碱基互补配对A = T,C≡G 核酸变性 在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。 核酸的变性、复性一级结构不变；氢键；碱基堆积力； 碱基配对 A＝T，C≡G 核酸的一般理化性质 多元酸，具较强的酸性。 DNA是线状高分子，粘度很大，碱性条件下稳定；RNA分子较小，粘度也小，对酸稳定。 核酸分子在机械力的作用下易发生断裂。 碱基有共轭双键，具紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm。可对核酸进行检测和定量，也可分析纯度。 核酸变性 ——加热、极端的pH、有机溶剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等。 材料与方法的选择 临床诊断与研究常见的标本——血液、尿液、唾液、组织及培养的细胞。 不同研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同要求，另外尚需考虑制备核酸所需的时间与成本。 不影响核酸制品质量与产量的前提下，应选安全的试剂与制备方案。 保持核酸的完整性（一） 尽量简化操作步骤，减少对核酸的破坏； 合适pH值（pH4－10） 过酸或过碱－破坏磷酸二酯键 减少机械剪切力，包括剧烈的溶液振荡、搅拌，使溶液快速通过狭长孔道，细胞突置于低渗溶液中，DNA样品反复冻融等都可引起DNA的降解。 常在0－4℃的条件下提取，还可降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解； 保持核酸的完整性（二） 抑制核酸酶活性： 内源或外源的各种核酸酶能破坏磷酸二酯键； DNA酶的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，可使用二价金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本可抑制DNA酶的活性； RNA酶，分布广泛，耐高温、耐酸碱，不易灭活。 技术路线的设计 核酸的释放 DNA和RNA一般均位于细胞内（病毒除外），分离纯化的第一步是裂解细胞、释放核酸。 应清除的杂质 非核酸的大分子污染物 －－主要是蛋白质、多糖及脂类物质； 非需要的核酸分子 －－分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子皆为杂质； 影响后继研究的溶液和试剂 －－加入的有机溶剂和某些金属离子； 核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法，其优点在于沉淀后易于调整核酸溶液浓度。另外还能清除部分杂质和某些盐离子。 原理：核酸在水溶液中以多聚阴阳离子的化合物形式存在，它与K+、Na+、Mg2+、Li+及NH4+等阳离子形成的盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团使DNA、RNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂。 核酸的沉淀与洗涤 常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁； 常用的有机溶剂为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。 核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。 核酸的鉴定与保存 1.浓度测定 紫外分光光度法/荧光光度法 紫外分光光度法：基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。这一物理特性为溶液中核酸浓度的测定奠定了基础。 琼脂糖凝胶电泳 －－－分离、鉴定和提纯核酸片段 凝胶中核酸的迁移率： ① 核酸分子的大小：线性双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。 ② 琼脂糖浓度：利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的核酸片段（0.3％