细胞毒性试验.ppt

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文档介绍

简述:本试验是将供试品浸提液与特定细胞系接触,通过对细胞死亡、增殖和抑制的定性观察和定量检测,评价样品对细胞的毒性作用及程度。 1、培养皿及枪盒用报纸包扎好,离心管的盖子拧开半圈,镊剪和离心管放入金属盒中,并将金属盒一侧的孔打开一半,将上述器具同置于压力蒸汽灭菌器内121℃灭菌30min。 2、灭完之后,放入超净工作台用风机吹30min。 ㈠ 、浸提液制备: 按下述规定将样品置离心管中浸提24h: 规则样品: a、x(样品厚度)<0.5mm时,按 6cm2/ml浸提 b、0.5mm <x<1mm时,按3cm2/ml浸提 C、x<1mm时,按1.25cm2/ml浸提 不规则样品: 按2g/ml浸提 ㈡、细胞悬液制备:将生长旺盛的细胞用胰酶消化后,加入培养液中止消化,吸管吹打混匀后滴于计数板上,于倒置荧光显微镜下计数四角的4个大方格内的细胞(对大方格内的边缘压线细胞按数上不数下,数左不数右的原则进行计数): 细胞密度=(4个大方格内细胞数/4) ×104 若实测细胞密度为8 ×105,而实验要求的密度为2× 104则应稀释40倍,96孔板用72个孔,每孔加100ul共需加7200ul,实际需配10ml细胞悬液(以防不够)。 由稀释倍数知需取0.25ml细胞悬液(可以适当多取点),取9.75ml培养液,放入培养皿中混匀(用前将培养皿用培养液清洗一下,使细胞更快的适应培养皿中的环境),用排枪取液加入96孔板中(动作要迅速,并且不断的混匀细胞,以防细胞下沉)。 ㈢、盖上盖子于台上轻轻水平转动后,用封口膜将四周封好,置5%co2培养箱37℃培养24h后,弃去80~90ul的原培养液,然后每孔加入100ul的浸提液或培养液,置co2培养箱继续培养72h。 ㈣、72h后每孔加入20ulMTT溶液,继续培养4h后将孔内液体完全弃去,加入150ul的DMSO,封口膜封好,置振荡器上振荡10mi

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