《生物芯片原理及技术 》教学课件 第3章 蛋白质芯片.pptx

蛋白质芯片;; 蛋白质组学(proteomics);基因芯片的局限性;生 物 芯 片;Example;High-content (高密度) 每张芯片同一样品可同时检测多达数百种指标。 Omics Tool (蛋白质组学的工具) 可用于分析反应的模式。 High Throughput (高通量) 每天完成多至上千样品的测试。 Miniaturization 微型化 节省样品和试剂, 实验空间,仪器设备 High sensitivity, specificity and reproducibility 高灵敏，高特异性，重复性 ;蛋白质芯片的意义;蛋白质芯片面临的挑战;根据制作方法和用途 ;又称蛋白质分析芯片或蛋白质表达芯片。 主要包括抗体芯片、抗原芯片、配体芯片、碳水化合物芯片等。 它是将具有高度亲和特异性的探针分子 (如单克隆抗体) 固定在基片上 , 用以识别复杂生物样品溶液 (如细胞提取物) 中的目标多肽 , 当放射性同位素或荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后 , 通过激光共聚焦扫描或电荷耦合检测装置 (CCD) 对信号的强度进行检测 , 从而判断样品中靶分子的数量。;是研究蛋白质间、蛋白质修饰、 DNA- 蛋白质间、 RNA- 蛋白质间、蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子蛋白质等相互作用的芯片。 它是将所研究体系中的每种天然蛋白质点加在基片上制成芯片 , 用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量平行研究。 要了解体系中有哪些蛋白质能与蛋白质结合 , 则将制成的蛋白质功能芯片与荧光标记的蛋白质温育 , 经荧光显微镜扫描检测可知 , 芯片上的亮点即为蛋白质的潜在结合物。蛋白质功能芯片主要用来检测蛋白质的生物学活性。 ;;蛋白质芯片操作流程;蛋白质芯片的制备 蛋白质芯片的检测 Liquichip液相蛋白芯片系统 蛋白质芯片的应用;载体的选择 捕获分子（探针） 固定方法 ;载体的选择;1.玻片 优点 常用的玻片表面修饰方法包括氨基、醛基、环氧基、聚赖氨酸、链霉亲合素修饰等。 这类载体大部分是通过共价键或特殊分子间的高亲合力来固定蛋白质结合牢固且构象变化较少;2.薄膜 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 将聚丙烯酰胺或琼脂糖等凝胶包被于玻片或滤膜表面，再引入可与蛋白质结合的活性基团，从而形成一种三维立体结构的载体 优点：对探针的固定能力强，能更好地保持蛋白质的活性;3.金膜 采用金膜作为蛋白质芯片的载体主要是通过表面分子自组装技术进行抗体固定;4.液相载体 由许多不同的小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中 ;理想的捕获分子 对靶分子具有高度特异性和亲和力 容易进行生产和操作 具有可利用的大分子文库用来建立高度密集的微阵列;抗体 适配体：即寡聚核苷酸 多肽 小分子配体 重组蛋白;抗体;适配体：即寡聚核苷酸;物理吸附：通过分子间作用力将蛋白质固定到载体表面 共价结合：指用功能基团修饰原本惰性的载体通过与氨基酸的支链基团共价连接形成不可逆的探针表面 间接偶联： 先在载体表面引入桥接分子，如生物素亲和素体系 DNA引导的固定：是一种新颖的探针固定方式，其原理是通过将蛋白探针预先与寡核苷酸交联，然后通过与载体表面上的互补链杂交的方式固定到载体表面 无细胞原位蛋白质合成技术;蛋白质芯片的点样方式均是采用合成后转移到载体上的方式 人工制备 自动化制备仪：接触式、非接触式（点喷印法、压电机器分配法）;无细胞原位蛋白质合成技术;以质粒为底物合成无细胞蛋白质芯片 原理是将亲和素、抗GST多克隆抗体作为捕获抗体和生物素标记的质粒混合，将其点特定的载玻片上。 之后在玻片表面铺上一层兔网织红细胞裂解物系统 表达的目的蛋白通过C端融合的GST标签与芯片上的抗多克隆抗体结合而原位 固定于玻片表面;2. 以PCR为底物合成无细胞蛋白质芯片 多重点样技术(MIST) 首先，将PCR产物作为模板采用芯片点样仪非接触式点样于氨丙基三乙氧基硅烷与Ni处理过的玻片表面随后，通过二次原位点样方式点上大肠杆菌抽提物系统，进行His标签蛋白以及GFP的表达。表达的His标签蛋白通过与芯片表面的Ni特异性结合而得以固定，经洗涤后可制备纯化的蛋白质阵列;3. 核酸到蛋白芯片技术(DAPA) 芯片上固定含有His标签的PCR扩增产物形成的DNA阵列，并与固定有Ni-NTA的芯片面对面放置。两芯片基底之间加入1张含有无细胞转录-翻译偶联的大肠杆菌抽提物系统的渗透性膜。DNA芯片上的PCR产物经无细胞系统表达出带双His标签的融合蛋白，通过渗透性膜，迅速固定于芯片对应位置上。 最终形成对应于阵列的 蛋白质芯片 ;蛋白质芯片的制备 蛋白质芯片的检测 Liquichip液相蛋白芯片系统 蛋白质芯